Ventajas del N₂ líquido (-180ºC) EN LA PURIFICACIÓN DE ADN GENÓMICO DE PLANTAS

-Permite pulverizar material biológico, por lo que los reactivos llegan mejor a todas las células →mayor eficiencia de extracción y mayor rendimiento de purificación

-Rotura de la pared celular, pero el núcleo permanece intacto → ADN intacto tanto en núcleo, mitocondrias y cloroplastos.

El ADN y el ARN tienden a copurificar debido a su similitud de propiedades físico-químicas. La forma más sencilla para eliminar ARN de una preparación de ADN es usar ARNasas.

· El tampón de lisis (SP1) contiene TRIS (tris-hidroximetil-aminometano) y se usa para tamponar a pH alcalino (7.5-8.5). También tiene EDTA (etilen-diamino-tetraacético) que siempre se utiliza, pues es un agente quelante de cationes divalentes. Secuestra Mg²⁺ porque son cofactores de enzimas que degradan el ADN (DNAsas) impidiendo que el ADN sea degradado por enzimas. Además contiene SDS (dolecil sulfato de sodio) que es un detergente iónico (con carga). SDS + ↑Tª = disuelve lípidos (desorganiza membranas celulares y desorganiza la mayoría de proteínas, pero no precipitan debido al detergente, que mantiene las proteínas disueltas.

· El tampón de precipitación (SP2) ayuda a precipitar. La sal sólida del detergente (↑solubilidad) es muy soluble en agua. Contiene acetato potásico. Gracias a esto, el Na⁺ es desplazado por el K⁺. La sal potásica del detergente tiene ↓solubilidad, y tiende a precipitar, llevando consigo lípidos y proteínas que tenía unidos.

El Eppendorf  se pone en frío porque las sales precipitan mejor a ↓Tª

Para conservar el ADN se utiliza:

TRIS: a pH 7.5-8.5. Si el pH no es alcalino → depurinación (pierden G y C)

EDTA: evita degradación por DNAsa

Congelar a -80ºC: se extrae con alícuotas para evitar que se rompa

· Preparación de agarosa: se pone la agarosa en el fondo. Ahora se añade TBE y después se pone en el microondas. Se utiliza en matraz de vidrio.

Para trabajar con ácidos nucleicos se utilizan tampones: TBE (Tris-ácido láctico-EDTA) y TAE (Tris-acetato-EDTA).

• Proporcionan electrolitos
• Mantienen el pH alcalino para evitar depurinación y mantener la carga
• Permite el paso de corriente de un electrodo a otro

A pH alcalino el ADN tiene carga

El tampón de carga incrementa la densidad de la muestra, confiere color a la muestra y permite seguir el transcurso de electroforesis. Como colorantes se usan el xilano-cianol y bromofenol.

Factor dilución = [ ] _I / [ ] _F

• Si conocemos V_FINAL → V_FINAL / F_D (Factor de dilución) 
• Si no conocemos V_FINAL → V_INICIAL / F_D -1

·Marcador de peso molecular: conjunto de fragmentos de tamaño conocido de la misma naturaleza de la muestra a estudiar. En este caso es ADNbc lineal.

1. Si el ADN  es circular, el avance no depende del tamaño, pues pueden estar superenrolladas.
2.  Si el ADN es lineal, se puede afirmar que corren más cuanto menor sea el tamaño.
3. Si el ADN es de cadena simple, se puede plegar, formando puentes de H y estructuras secundarias, por lo que influye la forma de la molécula.

Para que las moléculas avancen sólo en función del tamaño: electroforesis desnaturalizante. A elevadas temperaturas + agentes desnaturalizantes (urea, formanida)