PURIFICACIÓN DE ADN GENÓMICO DE PLANTAS

Para ello se utiliza el kit comercial o reactivos caseros.

·Ventajas del kit comercial:

• El fabricante comprobó que los reactivos funcionan correctamente
•  Se obtiene ADN de alta calidad, incluso superior a la necesaria para la PCR (mayor calidad que la obtenida por reactivos caseros). Calidad = tamaño y pureza.
•  Pureza: la mayoría de kit se basan en la interacción electroestática entre el ácido nucleico que se quiere purificar (con carga negativa) y una matriz sólida (con carga positiva). El ácido nucleico queda retenido en la matriz, y el resto se elimina (contaminante). La matriz de sílica, la fibra de vidrio se suelen usar.
• La interacción electroestática es promovida por agentes caotrópicos como la guanidina. NO se usan solventes orgánicos, como el cloroformo o el fenol (cancerígeno). Se usaban para eliminar lípidos y proteínas, incluso polisacáridos.

–Tamaño: se obtiene un tamaño ≥ 20 kb. Se minimiza la fractura mecánica del ADN de varias maneras:

•  Durante la trituración de la muestra se usa N₂ líquido
•  Realizar las mezclas de reactivos con suavidad
•  El kit aporta columnas de cromatografía dentro de un tubo colector donde está insertada la columna, donde se recoge el líquido que pasa por la columna. El movimiento del líquido a través de la columna es muy suave, por lo que no rompe el ADN.

·Problemas al purificar el ADN de plantas:

• Presencia de una pared rígida resistente. Se tiene que eliminar mediante enzimas (caro y tedioso) → protoplasto; o mediante fuerza →rotura mecánica del ADN.
• Presencia de metabolitos con propiedades físico-químicas similares a ácidos nucleicos como polisacáridos, polifenoles, etc. Estas sustancias tienden a copurificar con el ADN (contaminar el ADN)
• Presencia de metabolitos que degradan el ácido nucleico →degradación química
• Presencia de metabolitos que inhiben las enzimas utilizadas para manipular el ADN, como por ejemplo la DNA polimerasa.
• Presencia y abundancia de metabolitos indeseados depende de las condiciones de crecimiento, como el estrés (herida, infección, sequía), la edad de la planta, o condiciones lumínicas.

·Recomendaciones:

• Tejidos jóvenes y sanos
• Evitar nervios y zonas vascularizadas, pues son difíciles de triturar
• Evitar parénquima muy desarrollado, pues son ricos en polisacáridos
• Procesar el material biológico inmediatamente o conservarlo en frío (-80ºC) o desecar en menos de 24h usando sílica-gel.