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DETECCIÓN DE VARIANTES DEL NÚMERO DE COPIAS (CNV) DEL GEN AMY1 EN HUMANOS

Evolución humana: hace unos 6 millones de años el humano y el chimpancé derivaron del mismo antecesor. El tipo de cambio en la secuencia de nucleótidos es más relevante que el número de cambios, sobre todo cambios que impliquen diferencias respecto a una función para generar una nueva especie. La mayor parte de secuencias de evolución rápida en humanos son reguladoras (no codifican proteínas). Muchas están cerca de genes implicados en el desarrollo o genes que se expresan en el cerebro.

·Homólogo: origen evolutivo común entre 2 secuencias. Hay dos tipos:

  1. Ortólogos: auténticos homólogos.
  2. Parálogos: ver dibujo.

Hibridación genómica comparativa basada en micromatrices ADN:

Marcamos con una sonda el ADN y lo depositamos en un soporte sólido. Los pocillos de la micromatriz son diminutos. Consiste en hibridar genomas y combinarlos con diferentes tipos de sonda. La muestra y el control lo marcamos con fluorescentes diferentes. Ambos se mezclan, y se hibridan en la micromatriz. Si observamos un color intermedio sobre ambos, el genoma de la muestra tiene el mismo número de copias que el control.

–          Si hay un color de la muestra intacto, es que tiene mayor número de copias

–          Si hay un color del control intacto, es que ha habido pérdida de copias en la muestra.

 

RT-PCR: se cuantifica ARNm, pero la PCR no amplifica ARN, por lo que tiene que pasarse a ADN complementario mediante retrotranscripción.

Normalización: queremos analizar la cantidad ARNm de un gen problema. Usamos 2 muestras de ADN complementario.

A    gen problema   12                                   B  2

referencia          4                                                2

normalización    3                                                1

La expresión de A es 6 veces mayor que la de B (12:2)

En realidad, la expresión de A es 3 veces mayor que B (3:1)

 

POLIMORFISMO INDEL

Los microsatélites son altamente polimórficos (son muy variables en cada individuo: huella genética). Esto sirve para pruebas de paternidad o saber q ue individuos pertenece una muestra de sangre por ejemplo.

Geles poliacrilamida: tiene dos componentes (monómeros):

  1. Acrilamida: forma cadenas lineales enormes
  2. Bisacrilamida: se une a las cadenas de acrilamida perpendicularmente. Se crean poros.

En presencia de TEMED y PSA polimeriza. Estos geles son muy resistentes. El tamaño de los poros del gel es regulable. Son ideales para separar ácidos nucleicos que solo difieren en una sola base. Para ello es necesario añadir un agente desnaturalizante como la urea, para evitar la formación de estructuras secundarias para que se muevan en el gel en función exclusivamente del tamaño.

El PSA proporciona radicales libres de O2 en la mezcla para que el catalizador de la reacción, el TEMED los utilice y provoque la polimerización. Sin embargo, NO puede haber O2 molecular porque inhibe la polimerización del gel. Cuanto más rápida sea la reacción, el gel será más homogéneo.

Tanto por ciento de entrelazado: el estándar es un 5% de bisacrilamida.

Acrilamida 30% →30g/100ml